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    新普京官网研究方案

非编码RNA(Non-coding RNA)是指不编码蛋白质的RNA。其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 、microRNA 和lncRNA等多种已知功能的 RNA,还包括未知功能的RNA。

长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度>200bp的RNA,由RNA聚合酶Ⅱ转录,lncRNA具有保守的二级结构,大部分不编码蛋白质。LncRNA发挥功能的方式很广,可以与蛋白、DNA和RNA相互作用,参与多种生物学过程的调控。主要包括基因组表观遗传修饰、调控转录后翻译、发挥ceRNA、增强子RNA作用等,从而对细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、免疫等发挥调控作用。

新普京提供的非编码RNA服务:miRNA、lncRNA、tRFs

新普京官网研究方案(以lncRNA为例)

1、采用二代测序或芯片技术找出不同组样本差异表达的lncRNA

图1. LncRNA 差异表达聚类结果及差异表达火山图

2、lncRNA/miRNA筛选验证

采用RT-PCR或者qRT-PCR检测lncRNA/miRNA在不同组织和细胞中的表达水平。

图2. PVT1和 miRNA在宫颈癌组织中的表达

(Iden, M.et al.The lncRNA PVT1 Contributes to the Cervical Cancer Phenotype and Associates with Poor Patient Prognosis.PloS one.2016.May 27;11(5))

3、细胞系鉴定

采用对肝癌细胞(如hepG2、hep3b、huh7)STR位点和Amelogenin位点的基因分型技术,进行细胞鉴定。

Marker 细胞库信息
Allele1 Allele2 Allele3 Allele1 Allele2 Allele3
D5s818 13 13 13 13
D13s317 10 11 12 14
D7s820 10 11 12 14
D16s539 10 10 10 10
VWA 16 18 17 17
TH01 7 7 6 7
AMEL X X X X
TPOX 8 11 9 9
CSF1PO 11 11 8 8
D21S11 30 30

4、lncRNA功能及下游靶标分子研究

4.1、构建lncRNA/miRNA的过表达(基因敲除)稳转癌细胞株;

图3. 基因过表达/敲除后单克隆细胞株的筛选

图4. CRISPR/Cas9和慢病毒稳定细胞系

4.2、MTT/CCK8法测定细胞生长活力;

图5. 转染TP53TG1 减少了细胞的活力

(Diaz-Lagares A, et al.Epigenetic inactivation of the p53-induced long noncoding RNA TP53 target 1 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 22;113(47):E7535-E7544.)

4.3、流式细胞检测细胞凋亡;

图6. HCT-116 cells 稳定转染TP53TG1 24小时后检测细胞的凋亡率

(Diaz-Lagares A, et al.Epigenetic inactivation of the p53-induced long noncoding RNA TP53 target 1 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 22;113(47):E7535-E7544.)

4.4、软琼脂克隆形成实验;

图7. TP53TG1 抑制了HCT-116细胞的克隆形成

(Diaz-Lagares A, et al.Epigenetic inactivation of the p53-induced long noncoding RNA TP53 target 1 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 22;113(47):E7535-E7544.)

4.5、细胞划痕实验;

图8. 伤痕愈合实验检测 VIM 敲低和过表达对细胞侵袭力的影响

(Peng Zheng,Quantitative Proteomics Analysis Reveals Novel Insights into Mechanisms of Action of Long Non-coding RNA HOTAIR in Hela Cells.MCP. 2015.)

4.6、细胞体外Matrigel侵袭实验;

图9. 与siCONT细胞相比,siPVT1细胞侵袭力明显降低

(Iden, M.et al.The lncRNA PVT1 Contributes to the Cervical Cancer Phenotype and Associates with Poor Patient Prognosis.PloS one.2016.May 27;11(5))

4.7、Western blot检测肿瘤相关蛋白表达。

图10. 用不同浓度的EW-7197 (0.25, 0.5, 1.25 and 2.5 μM) 处理A549-CUG2 and BEAS-CUG2 细胞24 h。免疫印迹检测 CUG2, E-cadherin, N-cadherin, and vimentin 的表达

(Kaowinn S, Kim J, Lee J, Shin DH, et, al. Cancer upregulated gene 2 induces epithelial-mesenchymal transition of human lung cancer cells via TGF-β signaling. Oncotarget. 2016 Dec

5、蛋白质组学寻找调控的下游靶标分子

应用蛋白质组学iTRAQ(SILAC,SWATH)定量方法和生物信息学找到lncRNA/miRNA调控的靶标。

图11. 蛋白质组学ITRAQ/SWATH 和差异蛋白通路分析

6、采用FISH技术研究lncRNA在细胞中定位分布

图12. 目的lncRNA在细胞中的位置分布(18S和U6为内参)

7、lncRNA作用机制研究

7.1、采用体外转录技术,RNA pull down, LC- MS等技术手段检测与RNA互作的蛋白质。

图13. RNA pull down后质谱鉴定、WB检测

7.2、RIP验证与蛋白质结合的lncRNA或者lncRNA与miRNA的互作

图14. AP-1蛋白与RNA的相互作用RIP

图15. MS2- RIP实验原理图(表达Lnc-A的质粒富集miRNA1miRNA2的效率比不表达Lnc-A的MS2组明显提高。通过对照,说明MS2-A可以与miRNA1和miRNA2相互结合)

7.3、双荧光素酶基因检测miRNA和lncRNA/mRNA的互作情况

生物信息学预测分析

图16. 利用生物信息学方法预测lncRNA与miRNA的结合位点

双荧光素酶和RIP验证

图17. 双荧光素酶和RIP验证lncRNA可以与miR-26a结合

(C Cao, Zhang T, Zhang D, et al.The long non-coding RNA, SNHG6-003, functions as a competing endogenous RNA to promote the progression of hepatocellular carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122. )

8、动物实验

8.1、成瘤模型

图18. 肝癌裸鼠成瘤模型,通过活体成像和测量观察不同处理小鼠肿瘤的生长、转移情况

(C Cao, Zhang T, Zhang D, et al.The long non-coding RNA, SNHG6-003, functions as a competing endogenous RNA to promote the progression of hepatocellular carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122. )

8.2、普通药物模型或基因治疗模型

8.3、模式动物:CRISPR/Cas9敲除或敲入的模式动物

图19. 腺病毒注射小鼠尾静脉后,隔一段时间通过肺组织切片观察某基因对肺的影响

8.4、损伤修复模型

如骨断裂恢复模型

图20. 小鼠骨断裂后用SEC2处理,X-ray拍摄结果显示SEC2组小鼠恢复更快

(Xu J, Wu T, Sun Y, et al.Staphylococcal Enterotoxin C2 Expedites Bone Consolidation in Distraction Osteogenesis. J Orthop Res. 2017 Jun;35(6):1215-1225. )

参考文献

1、Budhu A, Forgues M, Ye QH, et al. Prediction of venous metastases, recurrence, and prognosis in hepatocellular carcinoma based on a unique immune response signature of the liver microenvironment. Cancer Cell. 2006 Aug;10(2):99-111.

2、Fidler IJ. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 2003 Jun;3(6):453-8.

3、Oca?a OH, Córcoles R, Fabra A, et al. Metastatic colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal transition inducer Prrx1. Cancer Cell. 2012 Dec 11;22(6):709-24.

4、Massagué J. TGFbeta in Cancer. Cell. 2008 Jul 25;134(2):215-30.

5、Faghihi MA, Modarresi F, Khalil AM, et al. Expression of a noncoding RNA is elevated in Alzheimer's disease and drives rapid feed-forward regulation of beta-secretase. Nat Med. 2008 Jul;14(7):723-30.