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CRISPR技术简介
文章来源:未知 作者:genecreate 发布时间:2017-04-13 10:59
  CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是新出现的一种由sgRNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在这一系统中,sgRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA 进行修饰的目的。
  虽然有很多CRISPR–Cas系统需要多种蛋白的参与,但是在很多细菌的胞内都只需要一种内切酶(endonuclease)——Cas9就足够了,我们将这种CRISPR–Cas系统也称作2型系统(type II systems)。
  Cas9内切酶在向导RNA的指引下能够对各种入侵的外源DNA分子进行定点切割,不过主要识别的还是保守的间隔相邻基序(proto-spacer adjacent motifs,PAM基序)。如果要形成一个有功能的DNA切割复合体,还需要另外两个RNA分子的帮助,它们就是CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA(trans -acting CRISPR RNA, tracrRNA)。crRNA( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物,此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。不过最近有研究发现,这两种RNA可以被“改装”成一个向导RNA(single-guide RNA, sgRNA)。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。最新的报道称,在多种类型的细胞和生物体内,这种RNA介导的Cas9酶切作用能够正常地行使功能,在完整基因组上的特定位点完成切割反应。这样就可以方便地进行后续的基因组改造工作了。
  细胞通常会通过两种方式对发生双链断裂的DNA进行修复,这两种方式分别是同源重组修复机制(homologous recombination, HR)和非同源末端连接修复机制(non-homologous end joining, NHEJ),不过在修复的过程中细胞有可能会对修复位点进行修饰,或者插入新的遗传信息。
  为满足不同实验需求,新普京现推出CRISPR/Cas9技术服务,可根据您的需要量身定制您专属的CRISPR/Cas9载体,包括pCas9/gRNA1 载体和pCas9/gRNA3 载体,并可利用pCas9/gRNA1或pCas9/gRNA3 载体进行基因敲除服务。
  (1)pCas9/gRNA1 载体可在哺乳动物细胞内同时表达人源化 Cas9 蛋白和 gRNA,只需转染一个质粒就能实现对靶基因的切割。

Cas9对DNA切割示意图

pCas9/gRNA1 载体
  (2)pCas9/gRNA3 载体可在哺乳动物细胞内同时表达人源化 Cas9Nickase 蛋白和 gRNA。
  Cas9Nicknase 是 Cas9 蛋白的 D10A 突变体,切割 DNA 单链。由于 DNA 上的 Nick 缺口会很快被细胞修复,一般不会造成基因突变。 Cas9Nicknase 需要成对的 gRNA 辅助才能实现 DNA 双链断裂。采用 Nicknase 蛋白可以提高基因敲除的特异性,但是对 gRNA 的设计要求较高。敲除效率也比 Cas9 蛋白低一些。简单地说, Cas9 基因敲除效率更高,操作更容易; Cas9Nicknase 特异性更高。

Cas9Nicknase对DNA切割示意图

pCas9/gRNA3 载体